年9月，莱顿大学莱顿生物治疗学部药物研究学术中心研究团队在著名期刊CirculationResearch上发表文章，利用单细胞转录组和单细胞ATAC技术揭示了人类动脉粥样硬化斑块的细胞特征，研究定义了14种不同的细胞群，包括内皮细胞、平滑肌细胞、肥大细胞、B细胞、T细胞和髓系细胞，并鉴定了多种细胞激活状态和细胞间转换，强调了疾病部位的细胞可塑性和细胞间通讯。最后，利用全基因组关联研究数据确定了心血管疾病易感性基因在病变巨噬细胞、内皮细胞和平滑肌细胞中富集。动脉粥样硬化斑块细胞群的详细描述将有助于发掘新的介入靶点。
单细胞转录组学解析人类动脉粥样硬化斑块特征
MicroanatomyoftheHumanAtheroscleroticPlaquebySingle-CellTranscriptomics
CirculationResearch
17.
莱顿药物研究学术中心
研究背景
全基因组关联研究（GWAS）已经确定了许多位点与心血管疾病的风险增加有关，但这些研究结果转化为新的治疗方案受阻，因为缺乏特定细胞群的信息和药物靶向候选基因的特异性表达模式。然而，人类颈动脉斑块的完整细胞组成，包括免疫细胞和非免疫细胞，仍然是未知的。因此，研究团队对在颈动脉内膜切除术中获得的晚期人类动脉粥样硬化斑块进行了单细胞转录组（scRNA-seq）和单细胞ATAC测序（scATAC-seq），并对斑块中的各种细胞类型及其激活状态进行了全面的描述，鉴定了CVD的GWAS风险位点的细胞类型特异性表达。研究思路
主要结果
1.scRNA-seq鉴定到斑块中的14种细胞群
为了检测人类动脉粥样硬化斑块的转录组，对18例患者（77%男性）的颈动脉内膜切除术组织进行消化，通过流式分选活细胞进行建库（图1A）。过滤细胞后，对个细胞进行无偏聚类，确定了14个细胞群（图1B和1C）。分析scRNA-seq数据与bulk-RNA-seq数据的相关性，以及检查患者间细胞群分布的差异，证实了除患者1外的数据的一致性。根据已知的标记基因进行细胞类型鉴定（图1B和1D），不同性别间的细胞群组成没有差异，细胞类型定义通过与bulk-RNA-seq数据集的相关性得到确认（图1E）。检测到3个非免疫细胞群（cluster8，9，10）和11个白细胞群（图1B和1D）。白细胞群包括5个淋巴细胞群（cluster0，1，3，4和11），5个髓系细胞群（cluster5，6，7，12和13），和1个混合细胞群（cluster2），没有明确的细胞类型定义，似乎包含凋亡的髓细胞和T细胞（图1B和1D）。在本次结果中，T细胞是最多的细胞群，占所有分析细胞的52.4%，而髓系细胞群占了18.5%。组织学分析证实，CD3+T细胞数量确实超过了CD68+细胞。图1tSNE可视化显示了14个不同的细胞群2.内皮细胞表现为激活和潜在转分化表达模式
内皮细胞（ECs）包含cluster9和cluster10（图1B和1C），将ECs重新提出来进行聚类，分出4个不同的亚群（E.0-E.3，图2A）。E.0、E.1和E.2表达经典内皮标志物CD34和PECAM1，以及血管内皮标志物TIE1。E.0表达ACKR1（与小鼠静脉ECs和血管滋养管有关）和PRCP（参与血管生成和受损内皮的再生）(图2B和2C)。E.1表达细胞外基质基因，E.2表达细胞迁移标记FGF18和HEG1。这两个群体都表达了VCAM1（图2C），它通过激活的内皮表达，并促进白细胞（如单核细胞和T细胞）的粘附和转移。综上所述，E.0、E.1和E.2代表活化的内皮细胞，内皮细胞通过细胞粘附和新生血管化以及介导白细胞外渗，在晚期病变中加重炎症。值得注意的是，E.3亚型表达了典型的平滑肌细胞（SMC）标志物，如ACTA2、NOTCH3和MYH11（图2C）。结合分群结果以及SMC相关通路的富集（图2D），表明该亚群可能正在经历内皮细胞向间充质细胞的过渡或反之亦然。为了验证这些发现，我们在连续的组织学切片上观察了ACTA2和CD34的表达。图2内皮细胞分为4个亚群3.斑块平滑肌细胞中合成表型占主导地位
Cluster8为平滑肌细胞SMCs（图1B和1C），可以分为2个亚群：具有收缩特征的clusterS.1（表达MYH11,ACTA2和TAGLN），类合成的clusterS.0（表达COL1A1,MGP和COL3A1）。在S.0群中典型SMC标记物的低表达和细胞外基质基因的上调表明这些细胞中有一部分来自斑块的纤维帽部分。这个群中有少量细胞是KLF4阳性，表明血管平滑肌细胞分化为合成或巨噬细胞样表型。4.斑块内T细胞为激活状态
淋巴细胞簇由一个B细胞群（cluster11，图1B和1C）和4个T细胞群组成。为了更详细地定义T细胞，将CD3+的clusrer0，1，3，4分为CD4+T细胞和CD8+T细胞。CD4+T细胞的可以分为5个亚群（CD4.0-CD4.4，图3A），它们的主要区别是激活状态（图3B和3C）。CD4.0和CD4.1表达细胞*性基因，如GZMA、GZMK和PRF1。CD4.0还表达CD28和GZMB，表明这些细胞是细胞*性CD4+CD28null细胞，先前被认为与不稳定心绞痛和重大心血管不良事件风险增加相关。此外，该细胞群中与适应性免疫反应相关的促炎症通路显著富集（图3D）。通过流式细胞术，我们证实了CD4+CD28null细胞的细胞*性特症，结果显示，与CD4+CD28+细胞相比，CD4+CD28-细胞中含有更多的颗粒酶B。CD4.2和CD4.4表达IL7R、LEF1和SELL，这些基因与na?ve和中央记忆表型相关。根据经典标记FOXP3、IL2RA和CTLA4的表达，最终确定CD4.3为调节性T细胞（图3B）。有趣的是，我们还在该簇中发现FOXP3与RORA、GATA3共表达，RORA增强调节性T细胞的免疫抑制功能，GATA3阻止向其他TH亚群极化。图3CD4+T分为5个亚群CD8+T细胞分为3个不同激活状态的亚群。CD8.0亚群被鉴定为效应记忆亚群，表达GZMK、GZMA和CD69。CD8.1亚群表现为终末分化的、细胞*性的CD8+T细胞谱，显示GZMB、TBX21、NKG7、GNLY、ZNF和CX3CR1的表达，缺乏CD69的表达。最后，CD8.2表现为静止的中央记忆性CD8+T细胞表型，表达LEF1、SELL、IL7R和LTB。与前人scRNA-seq数据不同的是，我们没有在CD8+T细胞中检测到明显的衰竭表型。细胞*性降低的CD8群显示CD69表达，表明近期T细胞受体（TCR）激活，未来研究这些CD8+群体是如何被激活的以及它们如何影响动脉粥样硬化的发病机制将是一个重要的研究方向。使用动脉粥样硬化小鼠实验模型表明，斑块中的大部分CD8+T细胞是抗原特异性的，但迄今为止，CD8+T细胞的斑块抗原仍然大多数不确定。因此，无法确定哪些抗原激活了动脉粥样硬化中的T细胞。5.促炎和抗炎巨噬细胞都存在于斑块中
cluster5表达HDC、KIT、CMA1和TPSAB1，定义肥大细胞群。cluster6，7，8和12，表达CD14和CD68（图1B和1C），这些细胞细分出5种不同的亚群My.0–My.4。My.0，My.1和My.2最有可能代表不同的巨噬细胞激活状态。My.0和My.1亚类由促炎巨噬细胞组成。My.0表现为最近招募的巨噬细胞的特征（白细胞跨内皮迁移和白细胞外渗信号，图4C，4D，4B）。My.1为表达TNF和toll样受体的巨噬细胞（图4B）。有趣的是，My.0和My.1都表达KLF4，KLF4通过抑制NF-κB驱动巨噬细胞向抗炎表型发展。与My.0和My.1相比，My.2没有明显的促炎标志物，并有巨噬细胞和泡沫细胞的迹象。它表达泡沫细胞标记基因（ABCA1、ABCG1、MMP9和OLR1，图4B），促纤维化标记（TREM2和CD9）。有趣的是，My.2细胞共表达平滑肌细胞marker（ACTA2）和巨噬细胞marker（LGALS3和CD68）。为了进一步鉴定3个亚群的特征，分析了各自的通路富集情况。My.0和My.1显示典型的炎症和免疫途径富集，表明细胞激活、募集和免疫细胞相互作用驱动其表型。同理，IngenuityPathwayAnalysis预测My.0和My.1主要受IL1A、IFNA、IFNG、IL1B等促炎因子控制。My.2的功能富集到代谢途径和LXR/RXR激活，该cluster是表达典型的泡沫细胞相关因子，包括APOE和LXR家族（Nr1h），My.1细胞正在获得泡沫特征。My.3表达树突状细胞标记物，如CD1C、CLEC10A和FCER1A，这个群体最有可能代表CD1c+树突状细胞。My.4表达CD3E，GNLY，FOXP3和CD2，表明My.4可能含有调节性T细胞。图4髓系细胞分为5个亚群
6.细胞间通讯导致斑块内的炎症
接下来，基于CellPhoneDBv2.0检测了不同细胞类型间的潜在配体-受体相互作用，以预测细胞间通信。淋巴细胞和肥大细胞的潜在相互作用绝对数量最低，而髓系细胞、内皮细胞和SMCs的相互作用数量较高（图5A）。随后，专门研究了髓系细胞特异的互作关系，髓系配体（图5B）和受体（图5C），观察到髓系细胞亚群的CSF1R与内皮细胞、平滑肌细胞、肥大细胞和髓系细胞上的CSF1相互作用。CCR1、CCR5与CD4+和CD8+T细胞的CCL5相互作用，B细胞的CXCR4与My.1细胞的CXCL12相互作用。髓系细胞具有吸引其他白细胞的潜能，例如My.1通过表达CCL3吸引CCR5+T细胞。此外髓系亚群上的PDGFB与内皮细胞上的PDGFBR相互作用表明，可能是髓系驱动的血管生成，这与斑块的不稳定有关。图5配体-受体相互作用分析7.髓系和T细胞的染色质可及性揭示了参与基因调控的转录因子
为了解释各细胞群特异的基因表达模式，并发现疾病驱动转录因子，接下来利用scATAC-seq，检测了人类斑块中髓系和T细胞的染色质开放情况。scATAC-seq鉴定了4个髓系细胞群和5个T细胞群。从scRNA-seq到scATAC-seq的细胞群群标签转移显示出与本次scATAC-seq分群边界的良好一致性，并检测到大多数scRNA-seq中的细胞群（图6A和6B）。巨噬细胞CSF1R、IL1B和T细胞NKG7染色质开放，并且巨噬细胞和T细胞细胞特征转录因子（SPI1和ETS1）motif的富集，证实了细胞类型之间的划分（图6C和6D）。髓系细胞和树突状细胞My.3中，IL12A的启动子区域是特定开放的，IL12A是细胞因子IL12的特异性亚基。此外CD4.0中观测到RUNX3和STAT3的motif染色质开放，RUNX3是CD8+T细胞特定TF，也是诱导CD4+T细胞*性基因的表达，STAT3是IL6和IL2信号通路的下游靶点。根据scRNA-seq数据，My.1显示了促炎TFmotif的富集（图6F），这与细胞中促炎基因的表达相匹配。在My.1细胞中，IRF9motif是开放的（图6G和6H）。此外，IRF和STAT转录因子也是I型IFN反应的关键调节因子，先前也被证明与动脉粥样硬化疾病相关。含有KLF4motif的位点染色质可及性增加，该位点除了抑制促炎程序外，还被证明参与了抗炎巨噬细胞的激活，血管SMCs向巨噬细胞的转化(图6F)。在My.2细胞中，LXR_RXRMotif可及性富集，并且NR1H3位点在My.2群体中被特异性打开（图6J）。与此同时，scRNA-seq数据同样显示My.2中NR1H3特异性上调（图6K）。图6scATAC-seq分析髓系细胞的染色质可及性8.GWAS基因座的细胞类型特异性富集
GWAS研究已经发现了个与冠心病相关的遗传易感性位点。然而，识别潜在关键基因作为新的治疗靶点仍然存在挑战。为此，在scRNA-seq细胞群中评估这些基因的表达，以研究它们在疾病相关组织中的表达。优先研究个蛋白质编码基因。我们比较个CAD相关基因与个细胞群特征基因，结果有74个基因明显重叠。其中，内皮细胞的cluster9，10中高表达SHE，KCNN3，VAMP5，SEMA3F，HDAC9，GIMAP1,NOS3,和DOCK6。巨噬细胞基因表达包含AMPD2、CTSS、IL6R、CAPG、GPX1、GNAI2、TRIB1、SH2B3、FES、C19orf38和VASP（图7A，7B和7D）。平滑肌细胞群cluster8和CD34+ECcluster10高表达ITGB、ARHGEF26、CXCL12、PTPN11、COL4A1、COL4A2、KANK2和GGT5。图7GWAS相关位点基因总结
研究团队对晚期人类动脉粥样硬化斑块中高度多样化的细胞群落进行了深入的描述。基于scRNA-seq和scATAC-seq，发现了促炎、细胞*性T细胞群体，巨噬细胞的多种激活状态及其相互作用，以及功能不同的内皮细胞。此外，研究还表明，通过整合GWAS数据，scRNA-seq数据可以应用于绘制CVD易感性位点到特定细胞群的图谱，并定义潜在的相关靶点，用于特定细胞类型的药物干预。博奥晶典科研服务覃琪
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